FastKing RT Kit (با gDNase)

RNA A-1 تخریب می شود

—— تصفیه RNA با کیفیت بالا و بدون آلودگی. موادی که RNA از آن استخراج می شود باید تا حد ممکن تازه باشد تا از تخریب RNA جلوگیری شود. قبل از واکنش RT ، یکپارچگی RNA روی ژل دناتوره شده را تجزیه و تحلیل کنید. پس از استخراج RNA ، باید در 100٪ فرمامید ذخیره شود. در صورت استفاده از مهار کننده RNase ، دمای گرمایش باید کمتر از 45 درجه سانتیگراد باشد و pH باید کمتر از 8.0 باشد ، در غیر این صورت بازدارنده تمام RNase محدود شده را آزاد می کند. علاوه بر این ، مهار کننده RNase باید در محلولهای حاوی 8 0.8 میلی مولار DTT اضافه شود.

RNA A-2 حاوی مهار کننده های واکنش رونویسی معکوس است

—— بازدارنده های رونویسی معکوس شامل SDS ، EDTA ، گلیسرول ، سدیم پیروفسفات ، اسپرمیدین ، ​​فرمامید ، نمک گوانیدین و غیره RNA کنترل را با نمونه مخلوط کرده و عملکرد را با واکنش RNA کنترل مقایسه کنید تا بررسی کنید که آیا یک مهار کننده وجود دارد یا خیر. رسوب RNA را با 70٪ (v/v) اتانول شستشو دهید تا مهار کننده ها حذف شوند.

A-3 آنیل ناکافی آغازگرهای مورد استفاده برای سنتز اولین رشته cDNA

—— تعیین کنید که دمای بازپخت برای آغازگرهای مورد استفاده در آزمایش مناسب است. برای هگزامرهای تصادفی ، توصیه می شود قبل از رسیدن به دمای واکنش ، دما را به مدت 10 دقیقه در 25 درجه سانتی گراد نگه دارید. برای آغازگرهای مخصوص ژن (GSP) ، GSP دیگر را امتحان کنید ، یا به oligo (dT) یا هگزامر تصادفی تغییر دهید.

A-4 مقدار کمی از RNA شروع

—— مقدار RNA را افزایش دهید. برای نمونه های RNA کمتر از 50 نانوگرم ، 0.1 میکروگرم تا 0.5 میکروگرم استیل BSA را می توان در سنتز cDNA رشته اول استفاده کرد

A-5 توالی هدف در بافتهای مورد تجزیه و تحلیل بیان نمی شود.

—— بافتهای دیگر را امتحان کنید.

واکنش PCR A-6 شکست می خورد

——- برای RT-PCR دو مرحله ای ، قالب cDNA در مرحله PCR نمی تواند از 1/5 حجم واکنش تجاوز کند.

A-1 آنیل غیر اختصاصی آغازگرها و قالبها

—— انتهای 3’ آغازگرها نباید حاوی 2-3 dG یا dC باشد. در سنتز رشته اول به جای آغازگرهای تصادفی یا oligo (dT) از آغازگرهای اختصاصی ژن استفاده کنید. در چند سیکل اول دمای پخت بالاتر و سپس دمای پخت پایین تر استفاده کنید. برای بهبود ویژگی واکنش ، از پلیمراز Taq DNA داغ برای PCR استفاده کنید.

A-2 طراحی ضعیف آغازگرهای مخصوص ژن

—— اصول یکسانی را برای طراحی پرایمر تقویتی دنبال کنید.

RNA A-3 آلوده به DNA ژنومی

—— RNA را با DNase درجه PCR درمان کنید. یک واکنش کنترلی بدون رونویسی معکوس برای تشخیص آلودگی DNA ایجاد کنید.

A-4 تشکیل دایمر آغازگر

—— آغازگرها را بدون دنباله های مکمل در انتهای 3 ’طراحی کنید.

A-5 منیزیم خیلی زیاد²⁺ تمرکز

—— منیزیم را بهینه کنید²⁺ غلظت برای هر قالب و ترکیب آغازگر

A-6 آلوده به DNA خارجی

—— از نکات مقاوم در برابر آئروسل و آنزیم های UDG استفاده کنید.

A-1 محتوای محصول رشته اول بسیار زیاد است

—— مقدار مرحله اول را در مرحله واکنش PCR معمولی کاهش دهید.

A-2 مقدار آغازگر بسیار زیاد در واکنش PCR

—— کاهش ورودی آغازگر.

A-3 چرخه های بسیار زیاد

—— بهینه سازی شرایط واکنش PCR و کاهش تعداد چرخه PCR.

A-4 دمای پخت بسیار پایین

—— افزایش دمای پخت برای جلوگیری از شروع و گسترش غیر اختصاصی.

A-5 تقویت غیر اختصاصی قطعات الیگونوکلئوتیدی تولید شده توسط DNase تجزیه DNA-استخراج RNA با کیفیت بالا برای جلوگیری از آلودگی DNA.

RT-PCR عبارت است از رونویسی RNA معکوس به cDNA ، و سپس از cDNA رونویسی معکوس به عنوان الگویی برای واکنش PCR برای تقویت قطعه هدف استفاده می کند. با توجه به شرایط خاص آزمایش ، آغازگرهای تصادفی ، Oligo dT و آغازگرهای اختصاصی ژن را انتخاب کنید. تمام آغازگرهای فوق را می توان برای mRNA سلول یوکاریوتی کوتاه بدون ساختار گیره مو استفاده کرد.

آغازگر تصادفی: مناسب برای RNA طولانی با ساختار گیره مو ، و همچنین انواع RNA مانند rRNA ، mRNA ، tRNA و غیره. آنها عمدتا برای واکنش RT-PCR قالب تک استفاده می شوند.

Oligo dT: مناسب برای RNA با دنباله PolyA (RNA پروکاریوتی ، ruku یوکاریوتی Oligo dT rRNA و tRNA دم PolyA ندارند). از آنجا که Oligo dT به دم PolyA متصل است ، کیفیت نمونه های RNA باید بالا باشد و حتی مقدار کمی تخریب میزان سنتز cDNA کامل را تا حد زیادی کاهش می دهد.

آغازگر مخصوص ژن: مکمل توالی قالب ، مناسب برای موقعیت هایی که دنباله هدف مشخص است.

دو راه وجود دارد:

1. روش مرجع داخلی: از لحاظ تئوری ، cDNA قطعات DNA با طول های مختلف است ، بنابراین نتیجه الکتروفورز اسمیر است. اگر فراوانی RNA کم باشد ، هیچ محصولی در الکتروفورز نشان داده نمی شود ، اما این بدان معنا نیست که هیچ محصولی با PCR تقویت نمی شود. به طور کلی می توان از مرجع داخلی برای تشخیص cDNA استفاده کرد. اگر مرجع داخلی نتایج داشته باشد ، اساساً می توان کیفیت cDNA را تضمین کرد (در برخی موارد ، اگر قطعه ژن هدف بیش از حد طولانی باشد ، ممکن است استثنا وجود داشته باشد).

2. اگر ژن شناخته شده ای تقویت شده توسط این الگو وجود داشته باشد ، می توان آن را توسط آغازگرهای این ژن تأیید کرد. تقویت مرجع داخلی لزوما به این معنی نیست که مشکلی در cDNA وجود ندارد. از آنجا که مرجع داخلی فراوانی بالایی در cDNA دارد ، تقویت آن آسان است. اگر cDNA تا حدی به دلایل مختلف تخریب شود ، از دیدگاه احتمال ، نتایج PCR ژنهای هدف با فراوانی کم تا حد زیادی تحت تأثیر قرار می گیرد. در حالی که مرجع داخلی هنوز در فراوانی زیاد است ، تقویت احتمالاً تحت تأثیر قرار نمی گیرد.

تا حدی RNA تجزیه می شود. تشخیص یکپارچگی و تصفیه RNA

محتویات RNA گونه های مختلف ممکن است متفاوت باشد ، اما به طور کلی ، RNA کل استخراج شده باید دارای دو نوار 28S و 18S شفاف در الکتروفورز ژل باشد و روشنایی نوار قبلی باید دو برابر دومی دوم باشد. نوار 5S نشان می دهد که RNA تخریب شده است و روشنایی آن متناسب با درجه تخریب است. تقویت موفقیت آمیز مرجع داخلی به این معنا نیست که هیچ مشکلی در RNA وجود ندارد ، زیرا مرجع داخلی به وفور زیاد است ، تا زمانی که تخریب شدید نباشد ، می توان RNA را تقویت کرد. OD₂₆₀/OD₂₈₀نسبت RNA خالص اندازه گیری شده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر باید بین 1.9 تا 2.1 باشد. مقدار کمی ناخالصی پروتئین در RNA نسبت را کاهش می دهد. تا زمانی که مقدار خیلی کم نباشد ، RT تحت تأثیر قرار نمی گیرد. آنچه برای RT بیشتر اهمیت دارد یکپارچگی RNA است.

گسترش ژن مرجع داخلی فقط می تواند نشان دهنده موفقیت RT باشد ، اما لزوماً به کیفیت رشته cDNA مربوط نمی شود. از آنجا که قطعات مرجع داخلی به طور کلی از نظر اندازه کوچک و از نظر بیان زیاد هستند ، موفقیت آنها در رونویسی معکوس آسان تر است. با این حال ، اندازه و بیان ژن هدف از ژنی به ژن دیگر متفاوت است. کیفیت cDNA را تنها با مرجع داخلی نمی توان قضاوت کرد ، مخصوصاً برای قطعات هدف بیشتر از 2 کیلوبایت.

برخی از نمونه ها دارای ساختارهای پیچیده ثانویه هستند ، یا دارای محتوای غنی از GC هستند ، یا با فراوانی کمی گرانبها هستند. در این موارد ، ترانسکریپتاز معکوس مناسب باید با توجه به اندازه قطعه مورد نظر و نمونه انتخاب شود. برای الگوهای RNA با محتوای GC بالا و ساختار ثانویه پیچیده ، باز کردن ساختار ثانویه در دمای پایین یا با رونویسی معکوس معمولی مشکل است. برای این الگوها ، Quant Reverse Transcriptase را می توان انتخاب کرد ، زیرا عملکرد رونویسی معکوس آن به وضوح بهتر از رونویسی معکوس سری M-MLV است ، که می تواند الگوهای مختلف RNA را به طور مcribeثر رونویسی کند و RNA را در حداکثر رشته اول در cDNA رونویسی کند. هنگام استفاده از کیت ترانس کریپتاز معکوس عمومی ، سیستم 20 میکرولیتر فقط می تواند 1 میکروگرم RNA کل را رونویسی معکوس کند. لطفاً به حداکثر ظرفیت RT کیت توجه کنید. اگر الگو بیش از حد اضافه شود ، رونویسی معکوس به وفور RNA را ترجیح می دهد. بنابراین ، بهتر است از حداکثر ظرفیت سیستم تجاوز نکنید.

A-1 تعیین کنید که آیا RNA به شدت تخریب شده است و آیا RT موفقیت آمیز است یا خیر

به طور کلی ، علت شکست تقویت مرجع داخلی اغلب در اثر تخریب RNA جدی ایجاد می شود. دلیل احتمالی دیگر خرابی معکوس رونویسی است. از مرجع داخلی نمی توان به عنوان استانداردی برای قضاوت در مورد کیفیت تک رشته cDNA استفاده کرد ، اما می توان از آن به عنوان یک استاندارد برای قضاوت در مورد موفقیت در رونویسی معکوس در صورت عدم وجود مشکل در کیفیت RNA استفاده کرد. مهمترین چیز در فرایند رونویسی معکوس حفظ دما و سیستم واکنش ثابت به منظور بهبود بازده واکنش است.

A-2 تعیین کنید که آیا آغازگرهای تقویت ژنهای مرجع داخلی قابل اعتماد هستند یا خیر و آیا مشکلی با معرفهای مورد استفاده در PCR وجود دارد یا خیر.

برای کمی سازی نسبی ، RNA باید قبل از رونویسی معکوس اندازه گیری شود ، که در بسیاری از کیت های رونویسی معکوس نیز لازم است ، برای مثال ، ورودی RNA را 1 میکروگرم تعیین کنید. از آنجایی که cDNA رونویسی معکوس یک محلول مخلوط شامل RNA ، oligo dT ، آنزیم ، dNTP و حتی اندک بقایای DNA است ، انحراف ایجاد می شود ، بنابراین تعیین دقیق cDNA غیرممکن است. بنابراین ، تعیین RNA ضروری است. با توجه به اینکه بازده معکوس رونویسی در بین نمونه های مختلف یکسان است ، مقدار cDNA بدست آمده باید یکسان باشد و تجزیه و تحلیل کمی می تواند مقایسه سطوح بیان ژن های مختلف را در مقدار یکسان RNA کل نشان دهد. هنگام انجام PCR کمی فلورسانس نسبی ، cDNA کمی ممکن است پس از رونویسی معکوس مورد نیاز نباشد زیرا ژن مرجع داخلی می تواند به عنوان مرجع عمل کند.

این به طور عمده به ژن ها مربوط می شود و رونویسی معکوس قطعه طولانی برای اکثر ژن ها امکان پذیر نیست. اولاً ، کارایی رونویسی معکوس بسیار کمتر از PCR است. ثانیاً ، منطقه غنی از GC و ساختار ثانویه بسیاری از ژنها ، رونویسی معکوس و PCR را محدود می کند. سرانجام ، ضمانت وفاداری و تقویت PCR به طور همزمان دشوار است. در فرایند رونویسی معکوس ، هیچ کس نمی تواند قطعه طولانی را برای ژن های کپی ضعیف ، به ویژه با استفاده از oligo dT ، تضمین کند. در مورد 5 'UTR با GC بیشتر ، حتی مشکل تر است. بنابراین ، هنوز یک روش منطقی است که متن را با پرایمرهای تصادفی معکوس کنیم ، محلهای برش طبیعی را در قطعه مورد نظر پیدا کنیم ، با بخشهایی تقویت کنیم و سپس هضم و بستن محدودیت را انجام دهیم. به طور کلی ، تقویت قطعات بزرگتر از 2 کیلوبایت دشوار است ، اما دستیابی به آنها همیشه غیرممکن نیست: 1. اول از همه ، یکپارچگی RNA/mRNA را تضمین کنید و استخراج TRIZOL ترجیح داده می شود. 2. کیت M-MLV RT-PCR را می توان مستقیماً استفاده کرد. زمان پخت را افزایش داده و تعداد چرخه را در فرایند تقویت به درستی افزایش دهید. متناوباً ، PCR تو در تو می تواند اعمال شود ، یا ابتدا یک یا دو واکنش را با طولانی شدن مناسب دناتوراسیون و افزایش زمان قبل از تقویت PCR طبیعی انجام دهد ، که ممکن است به گسترش قطعات کمک کند. به وفاداری پلیمراز توجه کنید. 3. Long Taq را می توان در PCR برای به دست آوردن نتایج ایده آل استفاده کرد. 4. برای کاربرد پروتئین ، پلیمراز با وفاداری بالا باید استفاده شود.

دو نوع ترانس کریپتاز معکوس توسط TIANGEN ارائه می شود: Quant/King RTase و TIANScript M-MLV. تفاوت اصلی بین آنها مقدار ورودی الگوها است. Quant یک ترانس کریپتاز معکوس منحصر به فرد است که با M-MLV متداول استفاده شده از ویروس لوسمی موش مولونی متفاوت است. Quant یک ترانسکریپتاز معکوس با کارایی بالا است که به صورت نوترکیب با مهندسی اشریشیاکلی بیان می شود. Quant برای تقویت 50 ng-2 میکروگرم RNA با فعالیت رونویسی معکوس بالا و عملکرد بالا مناسب است. در مقایسه با MMLV یا AMV معمولی ، بزرگترین ویژگی Quant این است که دارای تمایل بسیار قوی با الگوهای RNA است و می تواند الگوهای پیچیده را بدون تغییر رنگ در دمای بالا معکوس کند. برای الگوهای با محتوای GC بالاتر ، بازده معکوس بیشتر است. با این حال ، این رونویسی معکوس دارای فعالیت RNase H است ، که ممکن است بر طول محصول cDNA تأثیر بگذارد (مناسب برای الگوهای کمتر از 4.5 کیلوبایت). برای رونویسی معکوس معمولی ، ترانسکریپتاز معکوس TIANScript MMLV توصیه می شود. این RTase یک آنزیم اصلاح شده با فعالیت RNase H بسیار ضعیف است که برای سنتز cDNA طولانی (> 5 کیلوبایت) مناسب است.

رونویسی معکوس یک مرحله ای و تقویت PCR در یک لوله بدون باز کردن پوشش لوله بین سنتز و تقویت cDNA تکمیل می شود ، که برای کاهش آلودگی مفید است. از آنجا که همه نمونه های cDNA بدست آمده برای تقویت استفاده می شود ، حساسیت بیشتر است ، با حداقل 0.01 pg از کل RNA. برای موفقیت آمیز RTPCR یک مرحله ای ، آغازگرهای اختصاصی ژن به طور کلی برای شروع سنتز cDNA استفاده می شوند. روش دو مرحله ای ، یعنی رونویسی معکوس و تقویت PCR در دو مرحله انجام می شود. ابتدا رونویسی معکوس از یک الگوی RNA برای بدست آوردن cDNA انجام می شود و cDNA به دست آمده تحت یک یا چند واکنش مختلف PCR قرار می گیرد. روش دو مرحله ای می تواند از oligo (dT) یا آغازگرهای تصادفی برای سنتز اولین رشته cDNA استفاده کند و می تواند تمام اطلاعات mRNA را از نمونه ای معکوس رونویسی کند.