2 × Pfu PCR Mix

الگوی A-1

■ الگو حاوی ناخالصی های پروتئینی یا مهارکننده های Taq و غیره است —— الگوی DNA را تصفیه کنید ، ناخالصی های پروتئینی را حذف کرده یا DNA قالب را با کیت های تصفیه استخراج کنید.

den تغییر رنگ قالب کامل نیست —— به طور مناسب درجه حرارت تغییر رنگ را افزایش داده و زمان دناتوره شدن را طولانی می کند.

deg تخریب الگو —— دوباره الگو را آماده کنید.

آغازگر A-2

quality کیفیت پایین آغازگرها —— آغازگر را دوباره سنتز کنید.

■ تخریب آغازگر —— آغازگرهای با غلظت بالا را برای حفظ به حجم کم تقسیم کنید. از انجماد و ذوب چندگانه یا نگهداری طولانی مدت 4 درجه سانتی گراد خودداری کنید.

design طراحی نادرست آغازگرها (به عنوان مثال طول پرایمر کافی نیست ، دیمر بین پرایمرها ایجاد می شود ، و غیره) -طراحی مجدد آغازگرها (جلوگیری از ایجاد دایمر آغازگر و ساختار ثانویه)

A-3 Mg²⁺تمرکز

g منیزیم²⁺ غلظت بسیار پایین است —- منیزیم را به میزان مناسب افزایش دهید²⁺ غلظت: Mg را بهینه کنید²⁺ غلظت توسط یک سری واکنش از 1 میلی مولار تا 3 میلی مولار با فاصله 0.5 میلی مولار برای تعیین Mg بهینه²⁺ غلظت برای هر قالب و آغازگر.

دمای پخت A-4

temperature دمای پخت بالا بر اتصال پرایمر و قالب تأثیر می گذارد. —— دمای پخت را کاهش داده و شرایط را با گرادیان 2 درجه سانتی گراد بهینه کنید.

A-5 زمان تمدید

extension زمان تمدید کوتاه —— افزایش زمان تمدید.

پدیده ها: نمونه های منفی نیز نوارهای دنباله هدف را نشان می دهند.

A-1 آلودگی PCR

■ آلودگی متقاطع توالی هدف یا محصولات تقویتی —— احتیاطاً نمونه حاوی توالی هدف را در نمونه منفی پیپت نکنید یا آنها را از لوله سانتریفیوژ بیرون نریزید. معرفها یا تجهیزات باید اتوکلاو شوند تا اسیدهای نوکلئیک موجود از بین بروند و وجود آلودگی باید از طریق آزمایشهای کنترل منفی مشخص شود.

cont آلودگی واکنش دهنده - - معرفها را حذف کرده و در دمای پایین ذخیره کنید.

A-2 Primer

g منیزیم²⁺ غلظت بسیار پایین است —- منیزیم را به میزان مناسب افزایش دهید²⁺ غلظت: Mg را بهینه کنید²⁺ غلظت توسط یک سری واکنش از 1 میلی مولار تا 3 میلی مولار با فاصله 0.5 میلی مولار برای تعیین Mg بهینه²⁺ غلظت برای هر قالب و آغازگر.

design طراحی آغازگر نامناسب ، و توالی هدف دارای همسانی با توالی غیر هدف است. —— طراحی مجدد آغازگرها.

پدیده ها: نوارهای تقویت کننده PCR با اندازه مورد انتظار ، بزرگ یا کوچک ، ناسازگار هستند ، یا گاهی اوقات هم نوارهای تقویتی خاص و هم نوارهای تقویتی خاص ایجاد می شوند.

آغازگر A-1

prim ویژگی آغازگر ضعیف

—— آغازگر طراحی مجدد.

concentration غلظت آغازگر بیش از حد بالا است —— دمای دناتوراسیون را به درستی افزایش داده و زمان دناتوره شدن را طولانی می کند.

A-2 Mg²⁺ تمرکز

■ Mg²⁺ غلظت بسیار زیاد است —— غلظت Mg2+ را بطور مناسب کاهش دهید: Mg را بهینه کنید²⁺ غلظت توسط یک سری واکنش از 1 میلی مولار تا 3 میلی مولار با فاصله 0.5 میلی مولار برای تعیین Mg بهینه²⁺ غلظت برای هر قالب و آغازگر.

A-3 پلیمراز مقاوم در برابر حرارت

amount مقدار بیش از حد آنزیم —— مقدار آنزیم را به طور مناسب در فواصل 0.5 U کاهش دهید.

دمای پخت A-4

temperature دمای پخت بسیار پایین است —— مناسب دمای پخت را افزایش دهید یا روش پخت دو مرحله ای را اتخاذ کنید

چرخه PCR A-5

many چرخه های PCR بسیار زیاد —— تعداد چرخه های PCR را کاهش دهید.

آغازگر A-1—— ویژگی ضعیف —— آغازگر را دوباره طراحی کنید ، موقعیت و طول آغازگر را تغییر دهید تا ویژگی آن افزایش یابد. یا PCR تو در تو انجام شود.

الگوی DNA A-2

—— الگو خالص نیست —— الگو را تصفیه کرده یا DNA را با کیت های تصفیه استخراج کنید.

A-3 Mg²⁺ تمرکز

—— میلی گرم²⁺ غلظت بسیار زیاد است - منیزیم را به میزان مناسب کاهش دهید²⁺ غلظت: Mg را بهینه کنید²⁺ غلظت توسط یک سری واکنش از 1 میلی مولار تا 3 میلی مولار با فاصله 0.5 میلی مولار برای تعیین Mg بهینه²⁺ غلظت برای هر قالب و آغازگر.

A-4 dNTP

—— غلظت dNTP ها بسیار زیاد است —— غلظت dNTP را بطور مناسب کاهش دهید

دمای پخت A-5

—— دمای پخت بسیار پایین —— به طور مناسب دمای پخت را افزایش دهید

چرخه A-6

—— خیلی چرخه —— شماره چرخه را بهینه کنید

اولین قدم انتخاب پلیمراز مناسب است. پلیمراز معمولی Taq به دلیل عدم فعالیت اگزونوکلئاز 3'-5 'نمی تواند تصحیح شود و عدم تطابق ، کارایی گسترش قطعات را تا حد زیادی کاهش می دهد. بنابراین ، پلیمراز معمولی Taq نمی تواند به طور م fragثر قطعات هدف بزرگتر از 5 کیلوبایت را تقویت کند. پلیمراز Taq با اصلاح ویژه یا دیگر پلیمرازهای با وفاداری بالا باید برای بهبود کارایی پسوند و برآوردن نیازهای تقویت قطعه طولانی انتخاب شود. علاوه بر این ، تقویت قطعات بلند همچنین نیاز به تنظیم مربوط به طرح آغازگر ، زمان تغییر رنگ ، زمان تمدید ، pH بافر و غیره دارد. معمولاً ، آغازگرهایی با 18 تا 24 جفت باز می توانند منجر به عملکرد بهتر شوند. به منظور جلوگیری از آسیب رساندن به الگو ، زمان تغییر رنگ در دمای 94 درجه سانتی گراد باید به 30 ثانیه یا کمتر در هر چرخه کاهش یابد ، و زمان افزایش دما تا 94 درجه سانتی گراد قبل از تقویت باید کمتر از 1 دقیقه باشد. علاوه بر این ، تنظیم دمای فرمت در حدود 68 درجه سانتی گراد و طراحی زمان افزایش با توجه به سرعت 1 کیلوبایت بر دقیقه می تواند تقویت م ofثر قطعات بلند را تضمین کند.

میزان خطای تقویت PCR را می توان با استفاده از DNA پلیمرازهای مختلف با وفاداری بالا کاهش داد. در میان همه پلیمرازهای Taq DNA که تاکنون یافت شده است ، آنزیم Pfu کمترین میزان خطا و بیشترین وفاداری را دارد (به جدول پیوست مراجعه کنید). علاوه بر انتخاب آنزیم ، محققان می توانند با بهینه سازی شرایط واکنش ، از جمله بهینه سازی ترکیب بافر ، غلظت پلیمراز حرارتی و بهینه سازی تعداد چرخه PCR ، میزان جهش PCR را بیشتر کاهش دهند.