ماژول سنتز TNASeq RNA Frag/cDNA

در حال حاضر ، فناوری توالی یابی با توان بالا عمدتا بر اساس فناوری توالی یابی نسل بعدی است. از آنجا که طول خواندن فناوری تعیین توالی نسل بعدی محدود است ، ما باید دنباله کامل را به ترتیب به کتابخانه های قطعه کوچک تقسیم کنیم. با توجه به نیازهای آزمایش های توالی یابی مختلف ، ما معمولاً توالی یابی تک انتهایی یا توالی دو سر را انتخاب می کنیم. در حال حاضر قطعات DNA کتابخانه توالی نسل بعدی به طور کلی در محدوده 200-800 جفت باز توزیع شده است.

الف) کیفیت DNA ضعیف است و حاوی مهار کننده است. برای جلوگیری از مهار فعالیت آنزیم ها از نمونه های DNA با کیفیت بالا استفاده کنید.

ب) هنگام استفاده از روش بدون PCR برای ساخت کتابخانه DNA ، مقدار نمونه DNA کافی نیست. هنگامی که ورودی DNA تکه تکه شده بیش از 50 نانوگرم باشد ، می توان جریان کار بدون PCR را به صورت انتخابی در طول فرایند ساخت کتابخانه انجام داد. اگر تعداد کپی کتابخانه برای توالی مستقیم بسیار کم باشد ، کتابخانه DNA را می توان با PCR پس از بستن آداپتور تقویت کرد.

ج) آلودگی RNA منجر به تعیین کمی اولیه DNA می شود آلودگی RNA ممکن است در فرآیند تصفیه DNA ژنومی وجود داشته باشد ، که ممکن است منجر به کمی سازی دقیق DNA و بارگیری کافی DNA در حین ساخت کتابخانه نشود. RNA با درمان با RNase حذف می شود.

A-1

الف) قطعات کوچک (60bp-120 bp) ظاهر می شوند قطعات کوچک معمولاً قطعات آداپتور یا دیمرهایی هستند که توسط آداپتورها تشکیل شده اند. تصفیه با دانه های مغناطیسی Agencourt AMPure XP می تواند به طور موثری این قطعات آداپتور را حذف کرده و کیفیت توالی را تضمین کند.

ب) قطعات بزرگ پس از تقویت PCR در کتابخانه ظاهر می شوند اندازه قطعه DNA کتابخانه پس از اتصال آداپتور ، 120 bp افزایش می یابد. اگر قطعه DNA پس از بستن آداپتور بیش از 120 جفت باز افزایش یابد ، ممکن است ناشی از تقویت قطعه غیرطبیعی تقویت PCR بیش از حد باشد. کاهش تعداد چرخه های PCR می تواند از این وضعیت جلوگیری کند.

ج) اندازه غیر طبیعی قطعات DNA کتابخانه پس از بستن آداپتور طول آداپتور در این کیت 60 جفت باز است. هنگامی که دو انتهای قطعه به آداپتورها متصل می شوند ، طول فقط 120 جفت باز افزایش می یابد. هنگام استفاده از آداپتور غیر از آنچه در این کیت ارائه شده است ، لطفاً با تامین کننده تماس بگیرید تا اطلاعات مربوطه مانند طول آداپتور را ارائه دهد. لطفاً اطمینان حاصل کنید که جریان کار و عملکرد آزمایش مراحل توصیف شده در دفترچه راهنما را دنبال کنید.

د) اندازه قطعه DNA غیر طبیعی قبل از بستن آداپتور دلیل این مشکل ممکن است ناشی از شرایط اشتباه واکنش در طول تکه تکه شدن DNA باشد. زمان های مختلف واکنش باید برای ورودی DNA متفاوت استفاده شود. اگر ورودی DNA بیش از 10 نانوگرم است ، توصیه می کنیم زمان واکنش 12 دقیقه را به عنوان زمان شروع برای بهینه سازی انتخاب کنید و اندازه قطعه تولید شده در این زمان عمدتا در محدوده 300-500 جفت باز است. کاربران می توانند طول قطعات DNA را برای 2-4 دقیقه با توجه به نیاز خود افزایش یا کاهش دهند تا قطعات DNA با اندازه مورد نیاز را بهینه کنند.

A-2

الف) زمان تکه تکه شدن بهینه نیست اگر DNA تکه تکه شده بسیار کوچک یا خیلی بزرگ باشد ، لطفاً برای تعیین زمان واکنش به دستورالعمل های انتخاب زمان تکه تکه شده که در دستورالعمل ارائه شده است مراجعه کنید و از این نقطه زمانی به عنوان یک کنترل استفاده کنید. سیستم واکنش برای طولانی یا کوتاه شدن 3 دقیقه برای تنظیم دقیق تر در زمان تکه تکه شدن.

A-3

توزیع اندازه غیر طبیعی DNA پس از درمان تکه تکه شدن

الف) روش ذوب نادرست واکنش تکه تکه شدن ، یا این که معرف پس از ذوب شدن کاملاً مخلوط نشده است. معرف 5 × تکه تکه شدن مخلوط آنزیم را روی یخ ذوب کنید. پس از ذوب شدن ، با تکان دادن آرام قسمت انتهایی لوله ، معرف را به طور مساوی مخلوط کنید. معرف را گرداب نکنید!

ب) نمونه ورودی DNA حاوی EDTA یا سایر آلاینده ها است کاهش یون های نمک و عوامل شلات کننده در مرحله تصفیه DNA برای موفقیت آزمایش اهمیت ویژه ای دارد. اگر DNA در 1 × TE حل شده است ، از روش ارائه شده در دستورالعمل برای انجام تکه تکه شدن استفاده کنید. اگر غلظت EDTA در محلول نامشخص باشد ، توصیه می شود که DNA را تصفیه کرده و برای واکنش بعدی در آب دیونیزه حل کنید.

ج) کمیابی DNA اولیه نادرست اندازه DNA قطعه قطعه شده با مقدار ورودی DNA ارتباط تنگاتنگی دارد. قبل از درمان تکه تکه شدن ، تعیین دقیق DNA با استفاده از روشهای Qubit ، Picogreen و سایر روشها برای تعیین میزان دقیق DNA در سیستم واکنش ضروری است.

 د) آماده سازی سیستم واکنش طبق دستورالعمل عمل نمی کند آماده سازی سیستم واکنش تکه تکه شده باید بر اساس دستورالعمل ها بر روی یخ انجام شود. برای اطمینان از بهترین اثر ، همه اجزای واکنش باید روی یخ قرار گیرند و آماده سازی سیستم واکنش باید پس از خنک شدن کامل انجام شود. پس از اتمام آماده سازی ، لطفاً ضربه بزنید یا پیپت کنید تا کاملاً مخلوط شود. گرداب نزنید!

1. روش اختلاط نامناسب (گرداب ، نوسان شدید و غیره) باعث توزیع غیر طبیعی قطعات کتابخانه می شود (همانطور که در شکل زیر نشان داده شده است) ، بنابراین بر کیفیت کتابخانه تأثیر می گذارد. بنابراین ، هنگام تهیه محلول واکنش Fragmentation Mix ، لطفاً به آرامی به بالا و پایین پیپت کنید تا مخلوط شود ، یا از نوک انگشت برای تکان دادن و مخلوط کردن یکنواخت استفاده کنید. مراقب باشید با گرداب مخلوط نشود.

2. برای ساخت کتابخانه باید از DNA خلوص بالا استفاده شود

integrity یکپارچگی خوب DNA: نوار الکتروفورز بیش از 30 کیلوبایت است ، بدون دم

D OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. مقدار ورودی DNA باید دقیق باشد پیشنهاد می شود از روش های Qubit و PicoGreen برای کمی کردن DNA به جای Nanodrop استفاده شود.

4. محتوای EDTA در محلول DNA باید تعیین شود EDTA تأثیر زیادی بر واکنش تکه تکه شدن دارد. اگر محتوای EDTA زیاد است ، قبل از آزمایش بعدی باید تصفیه DNA انجام شود.

5. محلول واکنش تکه تکه شدن باید روی یخ آماده شود فرآیند تکه تکه شدن به دما و زمان واکنش (به ویژه پس از افزودن تقویت کننده) حساس است. به منظور اطمینان از صحت زمان واکنش ، لطفاً سیستم واکنش را روی یخ آماده کنید.

6. زمان واکنش تکه تکه شدن باید دقیق باشد زمان واکنش مرحله تکه تکه شدن مستقیماً بر اندازه محصولات قطعه تأثیر می گذارد ، بنابراین بر توزیع اندازه قطعات DNA در کتابخانه تأثیر می گذارد.

1. چه نوع نمونه ای برای این کیت قابل استفاده است؟

نوع نمونه کاربردی این کیت می تواند RNA کل یا mRNA تصفیه شده با یکپارچگی RNA خوب باشد. اگر از RNA کل برای ساخت کتابخانه استفاده می شود ، توصیه می شود برای حذف rRNA ابتدا از کیت کاهش rRNA (Cat#4992363/4992364/4992391) استفاده کنید.

2. آیا می توان از نمونه های FFPE برای ساخت کتابخانه با این کیت استفاده کرد؟

mRNA در نمونه های FFPE تا حدی با یکپارچگی نسبی ضعیف تخریب می شود. هنگام استفاده از این کیت برای ساخت کتابخانه ، توصیه می شود زمان تکه تکه شدن را بهینه کنید (زمان تکه تکه شدن را کوتاه کنید یا قطعه بندی را انجام ندهید).

3. با استفاده از مرحله انتخاب اندازه ارائه شده در دفترچه راهنمای محصول ، چه چیزی ممکن است باعث شود که بخش وارد شده کمی انحراف پیدا کند؟

انتخاب اندازه باید مطابق با مرحله انتخاب اندازه در این کتابچه راهنمای محصول انجام شود. در صورت وجود انحراف ، ممکن است دلیل این باشد که دانه های مغناطیسی در دمای اتاق متعادل نیستند یا کاملاً مخلوط نشده اند ، پیپت دقیق نیست یا مایع در نوک باقی مانده است. توصیه می شود از نکات با جذب پایین برای آزمایش استفاده کنید.

4. انتخاب آداپتورها در ساخت کتابخانه

کیت ساخت کتابخانه حاوی معرف آداپتور نیست و توصیه می شود از این کیت به همراه آداپتور TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378) استفاده کنید.

5. QC کتابخانه

تشخیص کمی کتابخانه: Qubit و qPCR به ترتیب برای تعیین غلظت جرمی و غلظت مولی کتابخانه استفاده می شوند. عملکرد دقیقاً مطابق با دفترچه راهنمای محصول است. غلظت کتابخانه به طور کلی الزامات توالی NGS را برآورده می کند. تشخیص محدوده توزیع کتابخانه: استفاده از Agilent 2100 Bioanalyzer برای تشخیص محدوده توزیع کتابخانه.

6. انتخاب شماره چرخه تقویت

طبق دستورالعمل ، تعداد چرخه های PCR 6-12 است و تعداد چرخه های PCR مورد نیاز باید با توجه به نمونه ورودی انتخاب شود. در کتابخانه های پربازده ، تقویت بیش از حد معمولاً در درجات مختلف اتفاق می افتد ، که پس از اوج محدوده هدف در تشخیص Agilent 2100 Bioanalyzer یا با تشخیص غلظت Qubit کمتر از qPCR ، با پیک کمی بزرگتر ظاهر می شود. خفیف بیش از حد یک پدیده طبیعی است که بر توالی کتابخانه و تجزیه و تحلیل داده های بعدی تأثیر نمی گذارد.

7. Spikes در نمایه تشخیص Agilent 2100 Bioanalyzer ظاهر می شود

ظاهر شدن سنبله ها در تشخیص بیوآنالیزر Agilent 2100 به دلیل تکه تکه شدن ناهموار نمونه ها است ، جایی که قطعات بیشتری در اندازه مشخص وجود دارد ، و این بعد از غنی سازی PCR آشکارتر می شود. در این مورد ، پیشنهاد می شود که انتخاب اندازه انجام نشود ، یعنی شرایط تکه تکه شدن را به مدت 15 دقیقه در انکوباتور 94 درجه سانتی گراد تنظیم کنید ، جایی که توزیع قطعه کوچک و متمرکز است و می توان همگونی را بهبود بخشید.